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光学显微镜物镜最重要的参数竟是它们,除了数值孔径外,还有个它?
发布时间: 2019-07-22
显微镜的物镜的数值孔径是衡量其聚光能力和解决在固定物体距离的精细标本细节。图像形成的光波通过试样,并输入一个倒锥形的目的,如在图1中示出。在此的光锥的纵向切片示出的孔径角,一个值,该值是由物镜的焦距。
 
物镜的数值孔径表达
角度μ是二分之一的孔径角(A)和相关的数值孔径,通过下面的公式:
数值孔径(NA)=(罪μ), 其中 n 是一个值,该值取值范围为空气中的从1.00到1.51为专门浸油物镜和试样的玻璃盖,前面的镜头之间的成像介质的折射率。许多作者为μ的数值孔径方程代替变量α。从这个等式中,很明显,当成像介质为空气(与折射率,N = 1.0),然后仅取决于其最大值为90° 的角度μ的数值孔径是。的角度μ的罪,因此,有一个最大的值1.0(罪(90°)= 1),这是用空气作成像介质(使用“干”的显微镜物镜的理论最大数值孔径的透镜作业) 。
然而,在实践中,它是用干燥的目标难以达到0.95以上的数值孔径值。图2示出一系列来自不同焦距及数值孔径的目标的光锥。光锥的变化,从7° 的角度μ增加图2中的(a)至60°,在图2(c),而所产生的增加的数值孔径从0.12至0.87,接近极限时,空气中的摄像介质上。
不同介质下的物镜数值孔径
       通过检查的数值孔径方程,但很明显,折射率为达到大于1.0的数值孔径的限制因素。因此,为了获得更高的工作数值孔径的目标前面的镜头和试样之间的介质的折射率必须增加。显微镜现在的目标是,使成像在另类媒体诸如水(折射率= 1.33),甘油(折射率= 1.47),和浸泡油(折射率= 1.51)。应谨慎使用这些目标,以防止不必要的文物时,会出现一个目标是用比它是专为不同的浸泡介质。我们建议显微镜从来不使用专为油浸无论是甘油或水的目标,虽然最近又出台了一些新的目标,将工作与多个媒体。如果有任何疑问,您应该检查与制造商。
大多数在60倍和100倍(或更高)之间的放大倍数范围内的目标的设计与浸油一起使用。上面的数值孔径方程通过检查,我们发现,最高的理论数值孔径获得的浸油是1.51(当罪(μ)= 1)。然而,在实践中,大多数油浸目标有一个最大的数值孔径为1.4,最常见的取值范围从1.0到1.35的数值孔径。
光学显微镜物镜最重要的参数竟是它们,除了数值孔径外,还有个它?
参观者被邀请去探索与μ的变化,用我们的交互式Java教程探讨如何数值孔径和放大倍数都涉及到一个客观的孔径角的数值孔径的变化。
也取决于一个客观的数值孔径,是在一定程度上,光学像差的校正量时。高度校正的目标往往有更大的数值孔径为各自的倍率,如下面的表1中示出。如果我们采取了一系列典型的10倍的目标,作为一个例子,我们可以看到,平场校正计划的目标,数值孔径增大对应色差和球面像差的校正:计划消色差透镜,NA = 0.25;计划萤石,NA = 0.30;并计划复消色差透镜,NA = 0.45。
物镜的数值孔径
放大 计划
消色差透镜
(NA) 计划
萤石
(NA) 计划
复消色差透镜
(NA)
0.5倍 0.025 N / A N / A
1X 0.04 N / A N / A
2倍 0.06 N / A 0.10
4倍 0.10 0.13 0.20
10倍 0.25 0.30 0.45
20倍 0.40 0.50 0.75
40倍 0.65 0.75 0.95
40X(油) N / A 1.30 1.00
60X 0.75 0.85 0.95
60X(油) N / A N / A 1.40
100×(油) 1.25 1.30 1.40
150X N / A N / A 0.90 表1
整个放大倍数的范围内,如表1中所示,在一系列类似的放大倍率的目标,增加光学校正因子之间增加数值孔径,此功能成立。大多数制造商努力确保他们的目标有最高的校正和数值孔径为每个类的目标是可能的。
显微镜的物镜的分辨率被定义为仍然可以被区分为两个独立的实体的标本上的两个点之间的最小距离。在显微镜的分辨率是有些主观的价值,因为在高放大倍率,图像可能出现的非锐化但还是可以解决的最大的客观能力。数值孔径确定一个目标的分辨能力,但显微镜系统的总分辨率也取决于台下聚光的数值孔径。在整个系统的数值孔径越高,分辨率越好。
正确对准显微镜的光学系统也是非常重要的,以确保最大的分辨率。台下聚光器必须相匹配的目标,相对于数值孔径调整为准确的光锥形成的孔径光阑。用于图像的标本的光的波长谱的分辨率的一个决定因素。更短的波长能够解决在更大程度上比波长较长的详细信息。有几个方程表达之间的关系的数值孔径,波长,和分辨率是来自:
R =λ/ 2NA (1)
R =0.61λ/ NA (2)
R =1.22λ/(NA NA(OBJ)+(条件)) (3) ,凡?分辨率(最小可分辨的两个对象之间的距离),NA =数值孔径,λ等于波长,NA(obj的)等于物镜的数值孔径,NA(电导率)是聚光镜的数值孔径。请注意,方程(1)和(2)不同的乘法因子,该因子是0.5公式(1)和方程(2)为0.61 。这些方程根据一些因素(包括光学物理学家提出了多种理论计算),考虑到目标和冷凝器的行为,不应该被认为任一项一般物理定律的绝对值。在某些情况下,如共聚焦荧光显微镜,分辨率可能实际上超过这三个方程中的任一项下的限制。其他的因素,如低的标本对比度和亮度不可能以较低的分辨率,往往不是,现实世界中的最大的R值(约0.25 微米,使用波长为550纳米的谱中)的数值孔径1.35至1.40,在实践中实现。表2提供了一系列决议(R)和数值孔径(NA)的物镜和校正。
分辨率和
目标类型的数值孔径
  目的型
  消色差 计划萤石 计划复消色差透镜
放大 NA 分辨率
(微米) NA 分辨率
(微米) NA 分辨率
(微米)
4倍 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375
10倍 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61
20倍 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37
40倍 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29
60X 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29
100X 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20
NA =数值孔径 表2
完美对齐,当在显微镜台下聚光适当匹配的目标,那么我们也可以替换到方程(1)和(2)的物镜的数值孔径,相加的结果,方程(3)式降低(2) 。要注意的一个重要的事实是,倍率不会出现作为任何这些方程中的一个因素,因为只有数值孔径和照明光的波长确定试样的分辨率。正如我们所提到的(可以看出,在方程)的光的波长是在显微镜的分辨率的一个重要因素。更短的波长产生更高分辨率的(低级为?值),反之亦然。在光学显微镜的最大的分辨能力,实现与近紫外光,有效的成像波长最短。近紫外光其次是蓝色,绿色,最后变为红色光的能力来解决标本细节。在大多数情况下,显微镜使用由钨卤灯泡照亮标本产生白光。集中于可见光550纳米左右,占主导地位的绿色光波长(我们的眼睛是最敏感的绿色光)。它是这样的波长,这是用于计算在表2中的分辨率值。在这些方程的数值孔径值也是很重要的,更高的数值孔径也将产生更高的分辨率,在表2中是显而易见的。分辨率的光的波长的效果,在一个固定的数值孔径(0.95),列于表3。
分辨率与波长
波长
(纳米) 分辨率
(微米)
360 0.19
400 0.21
450 0.24
500 0.26
550 0.29
600 0.32
650 0.34
700 0.37 表3
当从试样的各点的光通过物镜,并作为图像重构,在试样的各点出现在图像中被称为艾里图案的小图案(未分)。这种现象是由于通过X射线衍射或散射的光,因为它通过的微小部分,在试样中的空间与背面的圆形光圈的客观。中央最大的艾里模式通常被称为艾里斑,被定义为由第一最小艾里图案包围的区域,并包含84%的光能量。这些通风的磁盘组成的小同心光明与黑暗界,如图3所示。此图显示了作为分离距离的函数的的艾里磁盘和它们的强度分布。
物镜有可能形成的光斑
图3(a)所示含有一个中央最高(通常称为零级最高)包围同心1日,2日,3日,等等,为了最大亮度依次递减,弥补的衍射图案,基本上由一个假设的艾里的强度分布。图3(b)中示出的两个艾里磁盘和它们的强度分布的光学分辨率的极限。在这部分的身影,两个磁盘之间的间隔超过它们的半径,他们是解析。可以分解成独立的实体将在哪个限制两个艾里磁盘通常被称为瑞利判据。图3(c)显示了两个艾里磁盘和它们的强度分布在零阶极大值之间的中心到中心的距离小于这些极大值的宽度的情况下,两个磁盘不是个别解析的瑞利判据。
较小的艾里磁盘由物镜投射在形成的图像,更详细的检体,成为可辨。目标更高的修正(萤石和apochromats的)产生较小的艾里磁盘做修正较低的目标相比。以类似的方式,有更高的数值孔径的目标,也能够产生更小的艾里磁盘。目标的高数值孔径和总校正光学象差,可以区分试样中更精细的细节,这是主要的原因。
如何更有效的降低物镜像差
图4示出了一系列的焦距相同的假设目标成像的大小的艾里磁盘上,但不同的数值孔径的数值孔径的影响。与小数值孔径,艾里斑的大小较大时,在图4(a)所示。然而,作为一个客观的数值孔径和光锥角增加的艾里斑的大小减少为示出在图4中(b)和图4(c)。由此产生的图像实际上是一种镶嵌在目镜膜片水平,我们认为光明与黑暗的艾里磁盘。如果两个磁盘靠得太近其中央点交叉重叠,这些重叠的磁盘所代表的两个细节没有解决或分离,从而出现一个如上图所示,在图3。
在图像形成的一个重要的概念来理解是目标截获衍射光线的性质。只有在较高的(第一,第二,第三,等等)的衍射光的订单被捕获的情况下,干扰可以工作在中间像平面的目标重建图像。只有零阶光线被捕获时,它是重组的试样识别图像几乎是不可能的。当一阶的光线被添加到零阶射线,图像变得更加连贯,但它仍然缺乏足够的细节。只有当高阶射线被重新组合,该图像的代表真正的体系结构的试样。这是大的数值孔径的必要性的基础(以及随后的更小的艾里磁盘),以实现高清晰度的图像,用光学显微镜。
一天到一天的例行观察,大多数显微镜不要试图与他们的设备可能达到的最高分辨率的图像。这是只有在特殊的情况下,例如高倍率明场,荧光,DIC,我们努力达到极限显微镜和共聚焦显微镜。在显微镜的大多数用途中,这是没有必要使用高数值孔径的目标,因为标本很容易解决,使用较低的数值孔径物镜。这是特别重要的,因为伴随着高数值孔径和高倍率的非常浅的景深(这指的是在该地区的良好的聚焦的正下方或正上方被检查区域)和工作距离短的缺点。因此,在标本分辨率是不太重要的,放大倍数可以低,最好使用较低倍物镜的适度的数值孔径,以产生更多的工作距离和更多的景深的图片包含。
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